IGFBPrP1致肝纤维化信号转导通路的筛选与验证

【摘要】胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（insulin-likegrowthfactorbindingproteinrelatedprotein1，IGFBPrP1），又称为IGFBP7，是一种分泌蛋白，属于胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin-likegrowthfactorbindingproteins，IGFBPs）超家族成员，与胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，IGF)亲和力低，而与胰岛素呈高结合力，具有调节细胞增殖、分化、黏附、衰老、凋亡及血管形成等生物学活性。导师前期研究发现IGFBPrP1是肝纤维化新的致病因子，但其致肝纤维化作用的机制尚不完全清楚。目前已明确的致肝纤维化的信号转导通路有TGFβ通路、Jak-Stat通路、Rho-ROCK通路、NF-κB通路、Wnt通路、Hedgehog（Hh）通路、瘦素信号通路、PPAR介导的信号通路、血管紧张素Ⅱ受体介导的信号通路等。TGFβ通路包括TGFβ/Smad信号通路和非Smad信号通路。TGFβ/Smad信号通路是经典的肝纤维化信号转导通路；非Smad信号通路包括MAPK通路和PI3K/AKT通路等。导师在前期研究中对TGFβ相关通路进行了探索，发现IGFBPrP1可通过TGFβ/Smad信号通路发挥致肝纤维化作用，且可能与非Smad信号通路中的ERK/MAPK信号通路有关。但IGFBPrP1是否能通过其他信号通路发挥致肝纤维化作用尚不清楚。研究表明，众多信号通路在肝纤维化发生发展的不同环节发挥着重要作用，不仅TGFβ/Smad信号通路与非Smad信号通路之间，而且TGFβ通路与其他信号通路之间都存在着交互作用（crosstalk）。因此推测，IGFBPrP1也可能通过MAPK、PI3K/AKT等非Smad通路及其他信号通路发挥致肝纤维化作用。PCR芯片是荧光定量PCR与芯片技术的结合，仅关注那些与研究对象相关的某一信号通路或多个相关基因的表达，所研究的基因范围相对集中，通常只有几百个或更少的基因。与基因芯片相比，获得的信息具有更强的针对性和准确性。因此本实验拟通过RT2ProfilerTMPCR芯片筛选IGFBPrP1致肝纤维化作用的信号转导通路及差异表达基因，并对主要差异表达基因进行验证，以阐明IGFBPrP1致肝纤维化作用的部分机制，为抗纤维化治疗提供新思路。第一部分腺病毒介导IGFBPrP1基因转染大鼠肝组织目的：观察腺病毒载体能否通过尾静脉注射将IGFBPrP1基因成功转染大鼠肝组织及IGFBPrP1在肝组织的表达。方法：SD雄性大鼠98只，体重120-140g，随机分为3组：腺病毒基因组（Ad-IGFBPrP1，n=43）：通过大鼠尾静脉注射Ad-IGFBPrP14×109pfu/只；腺病毒空载组（Ad-EGFP，n=43）：通过大鼠尾静脉注射Ad-EGFP4×109pfu/只；正常对照组（N，n=12）：通过大鼠尾静脉注射同等剂量的生理盐水。各组分别于注射腺病毒后2/7w（n=3）、1w（n=8）、2w（n=8）、4w（n=8）、6w（n=8）、9w（n=8）末处死大鼠，留取血清和肝组织待测。荧光显微镜观察肝组织中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达；流式细胞仪检测肝组织EGFP阳性细胞的百分比；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot方法分别测定肝组织IGFBPrP1的mRNA和蛋白表达水平。结果：1.荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果均显示，一次性给予Ad-EGFP4×109pfu和重复给予（0w，2w）Ad-EGFP2×109pfu两种方式转染，大鼠肝组织均有EGFP表达，但一次性给予Ad-EGFP4×109pfu的方式转染效率更高（60.4%vs46.3%）。故后续实验中采用一次性给予Ad-EGFP4×109pfu进行转染。2.荧光显微镜下观察，腺病毒转染1w时，肝组织可见明亮的绿色荧光，EGFP表达达到高峰，转染2w后绿色荧光逐渐减弱，4w后基本消失。3.流式细胞仪检测结果显示，腺病毒转染1w时，肝组织EGFP阳性细胞最多，达到60.4%，腺病毒转染效率达高峰；2w后EGFP阳性细胞逐渐减少。4.qRT-PCR检测结果显示，腺病毒转染1w时，肝组织IGFBPrP1基因mRNA表达水平最高（5.57±1.52）。5.Westernblot检测结果显示，腺病毒转染2w时，肝组织IGFBPrP1蛋白表达达高峰（1.07±0.11），随后逐渐减低。结论：腺病毒载体通过尾静脉注射成功将IGFBPrP1基因导入大鼠肝组织。第二部分腺病毒介导的IGFBPrP1基因转染致大鼠肝纤维化目的：观察腺病毒介导的IGFBPrP1是否导致大鼠发生肝纤维化。方法：实验分组同第一部分。HE和Siriusred染色观察肝组织病理学改变和胶原纤维分布；Westernblot方法检测HSC活化标志物α-SMA蛋白的表达；羟脯氨酸（Hyp）含量测定观察肝组织胶原纤维的形成；全自动生化仪检测肝功能观察肝组织损伤程度。结果：1.HE和Siriusred染色结果显示，IGFBPrP1基因转染大鼠肝组织后，随着病变进展，肝细胞出现水样变性和脂肪变性，点状坏死，甚至灶状坏死，伴有炎细胞浸润，胆管增生。转染4w时汇管区出现增生的纤维组织，胶原纤维逐渐增多，由血管壁向肝小叶内延伸，在汇管区与汇管区之间以及中央静脉与汇管区之间相互连接，病变可达到纤维化S3期。2.Westernblot检测结果显示，随着纤维化病变进展，Ad-IGFBPrP1组肝组织α-SMA蛋白表达逐渐增强。转染9w时，α-SMA蛋白表达量增至Ad-EGFP组的20倍。3.肝组织Hyp含量检测结果显示，Ad-IGFBPrP1组肝组织Hyp含量随纤维化进展逐渐升高。4.血清学检测结果显示，Ad-IGFBPrP1组大鼠血清ALT和TBIL水平显著升高，与正常对照组和Ad-EGFP组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。各组大鼠血清TP和ALB水平在正常范围内，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：腺病毒介导的IGFBPrP1基因转染导致大鼠发生肝纤维化。第三部分PCRArray筛选参与IGFBPrP1致肝纤维化作用的信号转导通路的差异表达基因目的：通过PCRArray筛选出IGFBPrP1致肝纤维化的信号转导通路的差异表达基因。方法：SD大鼠随机分为3组（n=3）：Ad-IGFBPrP1组、Ad-EGFP组和正常对照组（N）。各组腺病毒处理同第一部分。各组分别于腺病毒转染2w末处死大鼠，留取肝组织待测。提取肝组织mRNA，逆转录为cDNA，然后qRT-PCR方法检测信号转导通路的差异表达基因。结果：检测SignalTransductionPathwayFinderPCRArray上84个相关基因的mRNA表达水平变化。结果显示，18条信号转导通路中有33个基因mRNA表达有差异，占检测基因的39.29%。其中17个基因mRNA表达上调，16个基因mRNA表达下调。这些差异表达基因涉及16条信号转导通路。其中核转录因子Egr1表达上调，Hedgehog通路的Hhip基因和PI3K/AKT通路的PTEN基因表达均下调。结论：IGFBPrP1可能通过多条信号转导通路促进肝纤维化发生发展，差异表达基因Egr1、Hhip和PTEN可能是IGFBPrP1致肝纤维化作用信号转导的关键基因。第四部分在IGFBPrP1诱导的肝纤维化大鼠肝组织中MAPK信号通路的差异表达基因目的：通过PCRArray检测在IGFBPrP1诱导的肝纤维化大鼠肝组织中MAPK信号通路的差异表达基因。方法：实验分组同第二部分。提取肝组织mRNA，逆转录为cDNA，然后qRT-PCR方法检测IGFBPrP1诱导的肝纤维化大鼠肝组织中MAPK信号通路的差异表达基因。结果：MAPK信号通路中有24个基因mRNA表达有差异，占检测基因的28.57%。其中19个基因mRNA表达上调，5个基因mRNA表达下调。这些基因按功能可分为转录因子基因、Raf调控蛋白基因、细胞周期蛋白基因等。其中Map2k2（MEK2）和Mapk3（ERK1）表达均上调。结论：IGFBPrP1可能通过激活MAPK信号通路的不同环节发挥致肝纤维化作用，通路中差异表达基因Map2k2（MEK2）和Mapk3（ERK1）可能是IGFBPrP1致肝纤维化作用信号转导的关键基因。第五部分在IGFBPrP1诱导的肝纤维化大鼠肝组织中部分差异表达基因的验证目的：验证部分差异表达基因在IGFBPrP1诱导的肝纤维化大鼠肝组织的表达。方法：实验分组同第一部分。应用qRT-PCR和Westernblot方法分别检测PCRArray筛选出的差异表达基因的mRNA和蛋白在IGFBPrP1诱导的肝纤维化大鼠肝组织的表达。结果：1.qRT-PCR检测结果显示，①Ad-IGFBPrP1组Map2k2（MEK2）和Mapk3（ERK1）基因的mRNA水平均升高，与正常对照组和Ad-EGFP组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；②Hhip和PTEN基因的mRNA水平在Ad-IGFBPrP1组显著降低，明显低于正常对照组和Ad-EGFP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；③与正常对照组和Ad-EGFP组相比，Ad-IGFBPrP1组Egr1基因的mRNA水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。2.Westernblot检测结果显示，①PTEN蛋白表达随肝纤维化病变进展逐渐减弱，各时相的PTEN蛋白表达与正常对照组和Ad-EGFP组相比，均有统计学差异（P＜0.05）。②腺病毒转染后，Egr1蛋白表达增强，转染2w时达到高峰，然后逐渐减弱。转染2w的Egr1蛋白水平与其他各组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：Map2k2（MEK2）、Mapk3（ERK1）、Hhip、PTEN和Egr1等差异表达基因共同调控IGFBPrP1发挥致肝纤维化作用，可能部分阐明了IGFBPrP1致肝纤维化的作用机制。第六部分IGFBPrP1和TGFβ1在致肝纤维化中的关系初探目的：初步探讨IGFBPrP1和TGFβ1在致肝纤维化中的关系。方法：实验分组同第一部分。Westernblot方法检测IGFBPrP1、α-SMA和TGFβ1蛋白在IGFBPrP1诱导的肝纤维化大鼠肝组织的表达，并观察它们在肝纤维化发展过程中的变化趋势。结果：Westernblot检测结果显示，腺病毒转染后，IGFBPrP1蛋白水平先升高，在转染2w时达到高峰，随后逐渐减低。α-SMA和TGFβ1蛋白表达均随着肝纤维化程度的增加而增加，在转染9w时达到高峰。肝组织Hyp含量在腺病毒转染4w后随时间延长逐渐升高，在转染9w时达到高峰。结论：IGFBPrP1刺激肝组织产生TGFβ1可能是IGFBPrP1致肝纤维化作用的主要途径。
【作者】郭晓红；
【导师】刘立新；
【作者基本信息】山西医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1；肝纤维化；信号转导通路；PCR芯片；筛选；

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